O jogo começa imediatamente após os eventos de Assassin’s Creed. Desmond Miles e uma aspirante a assassina, Lucy Stillman, escapam do laboratório de Abstergo, seguindo para um esconderijo dos assassinos. Desmond descobre que os assassinos, com poucos recursos e dinheiro, estão tendo dificuldades para vencer os templários. Lucy revela que uma equipe dos assassinos, formada por ela e os experientes em tecnologia Rebecca Crane e Shaun Hastings têm trabalhado em um novo dispositivo baseado no modelo original de Animus usado pela Abstergo, o Animus 2.0. Desmond, então, vê as memórias de um novo assassino através da nova máquina.
O jogador assume o papel de um jovem nobre que se tornou assassino, chamado Ezio Auditore da Firenze. O pai de Ezio e seus irmãos, acusados injustamente de trair a cidade de Florença, são executados em praça pública. Ezio também seria executado, porém conseguiu escapar da morte.

Ezio então parte junto com sua mãe e sua irmã para a vila dos Auditore em Monteriggioni, onde descobre que o seu pai era secretamente um assassino. Ezio passa a ajudar o seu tio Mario na guerra entre os templários e os assassinos, com o intuito de se vingar dos causadores da morte de sua família.
Salve Gorozinnho! Estou tendo um problema com este jogo, que em certos momentos do jogo, sou dessincronizado do nada (morro do nada) sendo que isso acontece sem motivos, poderia me ajudar a resolver este problema? Será que o problema é em algum arquivo do jogo?
Complicado saber o motivo, refaz a instalação pra ver se resolve
Já tentei, já tentei de tudo, é complicado mesmo
Já fiz isso, já fiz de tudo pra tentar resolver este problema, mas não estou conseguindo
cara, o mesmo problema aconteceu comigo, uma das primeiras missoes de entrega de carta eu silplismente bato em uma parede invisivel, deve ser algum problema com o proprio arquivo